اول از همه، هر دو EcoR1 و Xba1 هنگام هضم DNA (همانطور که Nde1) هضم می کنند، اورهانگ های 5' باقی می گذارند. در هر دو مورد، انتهای 3' فرورفته است، به همین دلیل است که پلی رمز می تواند پایه ها را اضافه کند. ثانیاً همه پلیمرازها فقط می‌توانند پایه‌ها را به انتهای 3 اینچ اضافه کنند، بنابراین Klenow 4 پایه به انتهای 3' عقب‌رفته هر دو محل اضافه می‌کند برای ایجاد انتهای صاف.
آیا آنزیم های محدودکننده 5 فسفات باقی می گذارند؟
بردارها و درج‌های هضم شده توسط آنزیم‌های محدودکننده حاوی تغییرات نهایی لازم (5' فسفات و 3' هیدروکسیل) هستند، در حالی که قطعات ایجاد شده توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) ممکن است اینگونه نباشند.
آیا می توان انتهای صاف را بست؟
بسته شدن انتهای بلانت
بستن انتهای بلانت شامل جفت شدن پایه انتهای بیرون زده نیست، بنابراین هر انتهای بلانت ممکن است به انتهای بلانت دیگری متصل شود. انتهای بلانت ممکن است توسط آنزیم های محدود کننده مانند SmaI و EcoRV ایجاد شود.
آیا Taq polymerase انتهای صاف ایجاد می کند؟
Yes… اگر در PCR مرحله نهایی اکستنشن را روی ۷۲ dC نگه دارید، Taq Polymerase A-Overhangs را اضافه می کند. بیشتر برای کلونینگ TA استفاده می شود.
چرا از قطعه Klenow در توالی یابی DNA استفاده کنیم؟
قطعه Klenow برای کارهای مبتنی بر تحقیق مانند: سنتز DNA دو رشته ای از الگوهای تک رشته ای بسیار مفید است . انتهای 3 اینچی عقب‌رفته قطعات DNA را پر می‌کنیم تا 5 اینچ اورهنگ بی‌رنگ شود. هضم کردن برآمدگی های 3 اینچی برآمده.
